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Molecular Cancer | 肝細胞癌中circMET介導免疫抑制
來源: | 作者:geneseed | 發布時間: 2020-05-28 | 267 次瀏覽 | 分享到:
2020年5月19日,復旦大學中山醫院的柯愛武、施國明周儉教授為共通訊作者在Molecular Cancer(IF=10.679)雜志上發表了一篇題為“Circular RNA circMET drives immunosuppression and anti-PD1 therapy resistance in hepatocellular carcinoma via the miR-30-5p/snail/DPP4 axis”的文章,闡述了肝細胞癌中高表達的circMET,通過miR-30-5p / snail / DPP4軸降解CXCL10來誘導癌細胞的免疫抑制。并發現DPP4的抑制劑西格列汀可以提高PD1阻斷免疫療法的療效([1])。

肝細胞癌(HCC)是最常見的肝惡性腫瘤,預后較差。迄今為止,治愈肝癌的唯一方法是手術切除或肝移植,但是大多數患者被診斷時即為晚期肝癌,不適合手術。此外,腫瘤通常會在術后復發,術后5年生存率很低。因此,迫切需要更深入地了解其作用機制并研發出新的治療藥物。染色體7q21-7q31的擴增與腫瘤的復發和多藥耐藥性有關,該區域的幾個基因在HCC發生過程中具有驅動基因的功能。作者旨在研究該區域中調節HCC起始和發育的關鍵環狀RNA(circRNA)。


circMET在HCC中高表達,并可以作為OS和術后復發的獨立預測分子

作者推測chr.7q21-7q31來源的circRNA可能作為肝癌的原癌基因或抑癌基因。為了驗證這一假設,使用qRT-PCR方法檢測來自chr.7q21-7q31的43種circRNA在四對肝癌組織和癌旁組織中的表達差異。在這些circRNA中,與癌旁組織相比,circMET(hsa_circ_0082002,長度為1214個bp的環狀RNA)的表達在HCC組織中最顯著且持續上調。


為了闡明circMET在HCC患者中的臨床意義,作者使用qRT-PCR檢測circMET在90對HCC樣本和匹配的癌旁組織中的表達差異,在由209個HCC組織組成的TMA中進行原位雜交。與癌旁組織相比,circMET的表達在腫瘤組織中顯著增加,并且它主要位于細胞質中。此外,circMET過表達與微血管浸潤、腫瘤包膜缺失、多瘤和晚期肝癌顯著相關。


circMET的表達還與總生存期(OS)和累積復發率相關。circMET低表達組的2年和5年總生存率明顯高于circMET高表達組,同樣,circMET低表達組的2年和5年累積復發率明顯低于circMET高表達組。多因素分析證實了circMET可以作為OS和術后復發的獨立預測分子。此外,circMET和c-Met的表達有一定的相關性。綜上所述,這些結果表明circMET的高表達可能在HCC的進展中起作用。


圖1  circMET在HCC中高表達,并可以作為OS和術后復發的獨立預測分子


circMET促進肝癌細胞的侵襲和轉移

為了更好地了解circMET在肝癌發生發展中的生物學功能,作者使用qRT-PCR方法檢測circMET在HCCLM3、HuH7、Hep3B和HepG2細胞中的表達水平。高轉移性的HCCLM3細胞中,circMET的表達最高,而低轉移性的HepG2細胞中,circMET的表達最低。之后,作者構建了circMET過表達和敲低的慢病毒質粒用于下一步實驗。Transwell實驗顯示,circMET的過表達/敲低會導致肝癌細胞侵襲能力的增強/降低。劃痕實驗顯示circMET的過表達/敲低會導致肝癌細胞傷口愈合加快/延遲。在克隆形成實驗中,異位表達circMET促進集落形成,而抑制circMET表達會減少集落形成。在細胞增殖和細胞周期分析中,circMET的表達對肝癌細胞增殖和細胞周期沒有明顯的影響。綜上所述,這些結果表明circMET是HCC的正性調節因子。


圖2  circMET會促進HCC的進展


circMET的高表達誘導上皮向間充質轉化(EMT)并增強腫瘤微環境的免疫抑制性

為了研究circMET促進肝癌轉移的機制,作者使用RNA-seq技術檢測轉染circMET的HepG2細胞和HepG2對照細胞的基因表達差異,發現364種上調的基因和225種下調的基因。GO和KEGG分析表明,差異表達的基因在腫瘤通路、趨化因子信號通路、TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路、細胞黏附、血管生成、細胞趨化、炎癥反應、趨化和蛋白水解等途徑中顯著富集。


接下來,為了進一步確定circMET在EMT和腫瘤免疫反應中的作用。作者分析了表達不同水平circMET的HCC細胞形態。低表達circMET的肝癌細胞表現出正常上皮細胞的典型鵝卵石樣外觀,而高表達circMET的肝癌細胞表現出紡錘狀的成纖維細胞形態,未發現兩組MET相關的mRNA有表達差異。此外,高表達circMET的肝癌細胞表現出上皮標記基因E-鈣粘蛋白的下調、轉錄因子Snail、間充質基因纖連蛋白1(Fn 1)和波形蛋白的上調,低表達circMET的肝癌細胞與之相反。


為了確定circMET在腫瘤免疫應答中的作用,建立轉染circMET的Hep1–6細胞和Hep1–6對照細胞,并將這些細胞皮下植入C57BL / 6小鼠中。植入Hep1–6-circMET細胞的小鼠荷瘤比植入Hep1–6對照細胞的小鼠更大。然后,使用液體蛋白芯片(LiquiChip)檢測兩組小鼠的血清細胞因子表達譜,其中CXCL10、CXCL16、CCL11、IL17、瘦素、CCL9、CCL17、Timp-1和TNFRSF1B的表達存在顯著差異,之后通過ELISA進行驗證。


重要的是,體內實驗表明,在對照組小鼠的腫瘤細胞中,腫瘤浸潤的CD8+淋巴細胞密度明顯高于過表達circMET的腫瘤細胞。此外,臨床數據表明,circMET的高水平與肝癌組織中腫瘤浸潤性CD8+淋巴細胞的低密度相關,而它的低密度預示著HCC患者的預后不良。因此,作者提出circMET通過誘導細胞EMT并增強腫瘤微環境的免疫抑制性來促進HCC的發展。


圖3 circMET通過誘導細胞EMT并增強腫瘤微環境的免疫抑制性來促進HCC的發展


circMET作為miR-30-5p家族的分子海綿來促進HCC的發展

考慮到circRNA具有充當miRNA海綿的分子機制,作者評估circMET是否可以作為某些miRNA的海綿來影響HCC的發展。為此,使用StarBase v3.0預測了385種候選的miRNA分子,再通過circRIP+qRT-PCR實驗進行驗證,結果顯示,circMET可以特異性富集miR-30-5p(miR-30a-5p、miR-30b-5p、miR-30c-5p、miR-30d-5p和miR-30e-5p)。


為了進一步驗證miR-30-5p和circMET的直接作用,采用RNA pull-down和雙螢光素酶報告基因實驗,均表明miR-30-5p和circMET存在直接的相互作用。此外,在HCCLM3和Huh7細胞中進行FISH,表明circMET與miR-30a-5p在細胞質中共定位。體外的transwell實驗表示,在高表達circMET的HCC細胞中敲低miR-30a / e-5p會導致侵襲能力增強。因此,circMET可以作為miR-30-5p的分子海綿來促進HCC的發展。


圖4  circMET作為miR-30-5p的分子海綿來執行功能


circMET通過miR-30-5p / snail / DPP4軸誘導HCC的免疫抑制

為了確定miR-30-5p促進肝癌進展的下游機制,將RNA-seq的結果進行分析,作者推測Snail可能是人類miR-30-5p的靶標。下一步預測了Snail中可能與miR-30a-5p結合的位點。雙螢光素酶報告基因分析證實Snail確實是通過該位點與miR-30a-5p相互作用。為了進一步闡明miR-30-5p在circMET誘導信號轉導中的作用,構建過表達/敲低miR-30-5p和circMET的慢病毒質粒分別轉導至HCCLM3和HepG2細胞中來檢測Snail表達,結果表明circMET過表達和miR-30a-5p敲低會促進Snail的表達,而circMET敲低和miR-30a-5p過表達會抑制Snail的表達。這些結果表明Snail是miR-30-5p的靶標,circMET可能通過miR-30-5p/Snail軸促進肝癌的進展。


之前的數據表明,circMET在EMT和免疫抑制方面起著重要的調控作用,但具體機制尚不清楚??紤]到Snail是一種轉錄因子,作者進行了CHIP-seq,來確定HepG2-circMET細胞中Snail結合位點的譜系,在9470種基因中共鑒定出42,479個高置信度的Snail結合位點。在基因啟動子區域(距轉錄起始區1kb以內、1-2kb和2-3kb)發現了2.22、2.17和1.94%的結合位點,34%的結合位點位于基因內含子區域,56.72%的結合位點位于遠端的基因間隔區。


將含有Snail結合位點的9470種基因和,HepG2-circMET細胞與HepG2對照細胞差異表達的589種基因取交集,獲得189種基因。通過GO分析,發現僅僅有27種基因與免疫相關并且可以被Snail調控。結合這些基因在更大的肝癌樣本隊列中的表達數據,這些數據來自癌癥基因組圖譜(TCGA)和RNA測序數據。作者通過排除COL1A1、COLEC11、CXCL12和MBL2進一步縮小了Snail調控基因的范圍,發現DPP4、PDGFB1和CSPP1可能是參與Snail介導免疫抑制的候選基因。使用雙螢光素酶報告基因實驗發現Snail通過與DPP4的增強子元件相互作用而顯著上調DPP4的表達,而另外兩個基因沒有受到Snail的直接或輕微調控。此外,還確定了Snail與DPP4之間的正相關,以及Snail與HCC組織中CD8+ T細胞之間的負相關。因此,作者得出結論,circMET過表達通過miR-30-5p / Snail / DPP4軸誘導HCC的免疫抑制。


圖5 circMET通過miR-30-5p / Snail / DPP4軸誘導HCC的免疫抑制


miR-30-5p / snail / DPP4軸通過降解CXCL10誘導免疫抑制

有研究報道DPP4可以阻斷趨化因子或其它免疫分子,因此,作者尋找DPP4的下游底物,并使用DPP4抑制劑西格列汀來探索miR-30-5p / Snail / DPP4軸在肝癌進展中的機制。在Hep1-6細胞中,circMET、Snail過表達或miR-30-5p敲低均可上調DPP4的表達。植入Hep1-6-circMET、?Snail和-shmiR-30a/e-5p細胞的小鼠腫瘤體積明顯大于對照組。


液相芯片分析顯示,植入Hep1-6-circMET、?Snail和-shmiR-30a/e-5p細胞的小鼠血清中CXCL10(MCXCL10)水平明顯降低,ELISA進一步證實了這一結果。趨化指數表明CXCL10在CD8 +淋巴細胞轉運中起重要作用。接下來發現DPP4抑制劑西格列汀增加了CD8+淋巴細胞轉運。因此,得出結論circMET通過miR-30-5p/Snail/DPP4/CXCL10軸下調CD8+淋巴細胞轉運來抑制免疫應答過程。


圖6 miR-30-5p/Snail/DPP4軸通過降解CXCL10誘導免疫抑制


西格列汀可以改善部分肝癌患者的抗PD1免疫治療反應

DPP4屬于一個由6個多向絲氨酸蛋白酶組成的家族,它們可以在蛋白和肽的N端裂解兩個氨基酸。第一種口服胰島素增強劑,西格列汀,一種選擇性的DPP4抑制劑,已被證實用于糖尿病的治療??筆D1阻斷免疫療法和其它療法的聯合應用已被證實可以改善腫瘤特異性T細胞免疫應答的療效和持續時間?;谏鲜雠c西格列汀相關的數據,作者預測西格列汀在HCC的臨床應用中可以增強淋巴細胞的轉運,改善腫瘤對PD1阻滯的反應性。作者研究了西格列汀和PD1抑制劑在Hep1-6-circMET和Hep1-6-Snai腫瘤模型中的聯合治療作用。結果表明西格列汀或PD1單抗會導致腫瘤生長延遲,重要的是,西格列汀+抗PD1治療組的腫瘤抑制率為100%。


在西格列汀處理的小鼠腫瘤中CD8+T細胞數量明顯增加,西格列汀和抗PD1抗體聯合西格列汀均對小鼠血清中DPP4活性有抑制作用。作者進行了一項回顧性隊列研究,以確定西格列汀是否能增強腫瘤中CD8+T淋巴細胞的轉運。這項研究包括8名在2018年1月至2019年7月期間接受西格列汀治療的肝癌患者,以及32名未接受西格列汀治療的肝癌患者(1:4匹配)作為對照組。結果表明,接受西格列汀治療的肝癌組織CD8+T細胞浸潤較高,而未接受西格列汀治療的肝癌組織CD8+T細胞浸潤明顯較低。提示西格列汀有促進淋巴細胞轉運的作用。因此,得出結論,circMET/miR-30-5p/Snail/DPP4軸參與了肝癌的免疫抑制,并且西格列汀可以提高PD1阻斷免疫療法的療效。


圖7 西格列汀可以改善部分肝癌患者的抗PD1免疫治療反應

參考文獻

1. Huang XY, Zhang PF, Wei CY, et al. Circular RNA circMET drives immunosuppression and anti-PD1 therapy resistance in hepatocellular carcinoma via the miR-30-5p/snail/DPP4 axis. Mol Cancer. 2020;19(1):92. Published 2020 May 19. doi:10.1186/s12943-020-01213-6
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